Diagnóstico y cuantificación de hongos toxígenos mediante ensayos de PCR

Las micotoxinas son metabolitos secundarios producidos por ciertas especies de hongos cuya ingestión, inhalación  o absorción cutánea producen alteraciones, provocan enfermedades o causan la muerte en animales y humanos.

Son objeto de interés a nivel mundial debido a las importantes pérdidas económicas que conllevan sobre la productividad animal y vegetal, y sobre la salud humana. Numerosos organismos gestionan y regulan los niveles máximos permitidos para la mayoría de las micotoxinas de interés y para cada grupo o tipo de alimentos, siendo Europa donde las medidas son más restrictivas. Estos valores son revisados contínuamente en base a nuevos conocimientos, nuevas micotoxinas u organismos productores y nuevos cultivos o matrices susceptibles de contaminación. 

El disponer de herramientas de diagnóstico precisas que permitan la monitorización de las especies y el reconocimiento de las numerodas especies de hongos productores sin requerir a expertos taxónomos, se ha convertido en una estrategia que despertó un gran interés en la comunidad científica y por ello un gran desarrollo en los últimos 20 años. Hasta el desarrollo de las herramientas moleculares, la identificación de especies fúngicas se basaba en características morfológicas y culturales que requería expertos en taxonomía, consumían tiempo y en algunas ocasiones faltaba precisión. El diseño de cebadores se convierte en un paso crucial y numerosos abordajes se han ido realizando, desde cebadores para genes constitutivos hasta cebadores para genes de la propia ruta biosintética. Nuestro trabajo ha estado siempre centrado en el uso de las secuencias o espaciadores intergénidos del rDNA, ITS1, ITS2 e IGS. La presencia de los genes que codifican estas secuancias repetidos en tandem y en centenares de copias permiten incrementar el grado de sensibilidad del ensayo.

En nuestro grupo hemos desarrollado ensayos basados en PCR para la detección de las principales especies toxígenas del género Aspergillus, se han diseñado cebadores y protocolos para las principales especies de la seccion Nigri, agregado A. niger y  A. carbonarius; para especies de la sección Circumdati como A. ochraceus, A. steinii y A. westerdijkiae; y para la sección Flavi como A, parasiticus y A. flavi.

El otro grupo importante en el que hemos trabajado es Fusarium, un productor de micotoxinas entre las que destacan los tricotecenos y las fumonisinas. Hemos desarrollado cebadores y protocolos para las especies más significativas, dentro de las cuales destacamos las principales especies productoras de tricotecenos, un importante grupo de micotoxinas que son potentes inhibidores de la síntesis de proteínas: F. graminearum, F. culmorum (productores de tricotecenos tipo B) y  F. poae, F. equiseti y F. sporotrichioides (productores de tricotecenos tipo A). Estos métodos son rápidos, sensibles y específicos y representan una buena herramienta para la detección de estas especies, se pueden aplicar a las propias matrices alimentarias y así prevenir la entrada de micotoxinas en la cadena alimentaria. Otras especies de Fusarium son importantes patógenos que afectan a los cultivos de maíz y producen un grupo de micotoxinas, descubiertas en 1988, conocidas como fumonisinas. Dentro de las especies más relavantes destacan F. verticillioides y F. proliferatum.

No sólo el diagnóstico ha sido el interés de nuestro grupo, sino que también hemos desarrollado protocolos para la cuantificación, para ello hemos trabajado con qPCR, esta técnica no solo proporciona resultados cualitativos sino que permite la cuantificación de la contaminación, calculando la cantidad de DNA fúngico presente y de esta manera estimar el nivel de contaminación de una muestra natural, una matriz alimentaria o alimento. 

Prevención y control de hongos toxígenos y micotoxinas en productos alimentarios

Las estrategias de prevención son las mejores medidas para evitar la presencia de micotoxinas en alimentos. Numerosos procedimientos se han establecido con este objetivo. En nuestro caso nuestra investigación se ha orientado al conocimiento de las condiciones de producción de la micotoxina con el fin de establecer condiciones limitantes y por otra parte, analizar estrategias de control bien con agentes biológicos, bien con extractos vegetales.

El conocimiento de los factores físico-químicos que afectan y modulan el crecimiento y la producción de micotoxinas permite establecer medidas de control para disminuir la presencia de estas toxinas tanto en precosecha como en poscosecha, por ello una buena parte de nuestro trabajo se ha dirigido al conocimiento y determinación de los perfiles de crecimiento y biosíntesis de micotoxinas en condiciones de temperatura, estrés hídrico y diversidad de sustrato, considerando la variabilidad intraespecífica para predecir su potencial en nuevos escenarios esperables.

El cambio climático se reconoce como un hecho cierto con un impacto aún desconocido en multitud de sectores, afectando a la agricultura y a la Seguridad Alimentaria, incluyendo por supuesto la diversidad y distribución de diferentes especies fúngicas toxígenas. Sólo este conocimiento permite establecer medidas de control sencillas que limiten la acumulación de estos compuestos en los alimentos. Nuestros estudios se han realizado en áreas climéticas diferentes de nuestro país así como sobre aislados de otras regiones climáticas diferentes (Norte de Africa), la distribución y predominancia de especies toxígenas depende de numerosos factores, el hospedador, las complejas interacciones de la comunidad biótica, la localización geográfica y especialmente, factores ambientales, solo su conocimiento permitirá preveer comportamientos y adelantarnos a situaciones de riesgo en un futuro inmediato.

Dentro de las estrategias de descontaminación, el esfuerzo de nuestro grupo está orientado al control biológico. El uso de agentes de control no es algo nuevo sin embargo la utilización de microorganismos antagónicos frente a hongos productores de micotoxinas es algo más novedoso. Entre las principales ventajas que ofrece el control biológico con microorganismos antagónicos se encuentra la posibilidad de formar parte de una estrategia integrada, siendo compatible con otros tratamientos y permitiendo disminuir la utilización de agentes químicos.

En nuestro grupo hemos trabajado y seleccionado diferentes levaduras que controlan el crecimiento y la producción de micotoxinas en diferentes especies de hongos.

Desarrollo de herramientas moleculares para la detección y tipado de levaduras de importancia industrial.

El riesgo de la alteración de alimentos por levaduras ha aumentado en los últimos años debido a las formulaciones de nuevos productos, a los nuevos métodos de preservación no-termales y a la sustitución de tratamientos de conservación tradicionales por otros más suaves, respondiendo a las demandas de los consumidores. Nuestra investigación puede proporcionar herramientas de intervención manejables  y efectivas que permitan el rastreo desde su localización en fábrica a las materias para identificar su origen. Esto sólo se puede hacer con métodos moleculares de detección o de tipado que permitan identificar la(s) cepa(s) contaminantes  allí donde se encuentren. Con este abordaje hemos diseñado un método molecular de tipado para la levadura osmotolerante Zygosaccharomyces rouxii (Wrent et al. 2010) y un método también molecular para la detección rápida de D. hansenii y su diferenciación de otras especies comúnmente encontradas en alimentos (Wrent et al. 2015).

Levaduras contaminantes de alimentos: deterioro por producción de gas o utilización de conservantes

El equipo  de Levaduras tiene  gran experiencia  en el  estudio  del  deterioro  de alimentos  por  levaduras.  Se ha especializado  en dos tipos  de deterioro  característicos  de estos microorganismos:  la  producción  de  CO₂ fermentativo  que produce alteración  por hinchamiento  y la conversión del conservante ácido sórbico o sus sales, genéricamente denominados sorbatos, en 1,3 pentadieno. Este producto volátil presenta un desagradable olor a “petróleo” que provoca el rechazo de los consumidores y las consecuentes pérdidas económicas. El grupo ha desarrollado una prueba rápida para la detección de este compuesto volátil (Casas et al. 2004). Stratford et al. (2007) fueron los primeros en relacionar la capacidad de producción de 1-3 pentadieno con la descarboxilación de ácido sórbico debido a la presencia y expresión del gen PAD1 en Saccharomyces cerevisiae. Utilizando el método descrito por Wrent et al. 2014 hemos podido comprobar como todas las cepas de las especies ensayadas de la levadura Debaryomyces hansenii presentan en su genoma una secuencia homologa con dicho gen. Actualmente estamos estudiando su implicación en el proceso de descarboxilación con el objetivo de diseñar sondas que sean capaces de diferenciar las cepas productoras de las que no lo son.

Estudio y análisis de los genes de las rutas biosintéticas de hongos toxígenos.

El conocimiento de las rutas de síntesis de micotoxinas es imprescindible para poder conocer la regulación de su producción y establecer métodos de control efectivos. En algunos casos, como en aflatoxinas, tricotecenos y fumonisinas, por ejemplo, esta ruta se conoce en su totalidad desde hace años. Sin embargo, la ruta de producción de ocratoxina A no se ha elucidado hasta el momento. En nuestro grupo, hemos identificado tres genes en A. steynii situados en la misma región genómica cuyos niveles de expresión se correlacionan con la producción de dicha micotoxinas. Los tres genes codifican para una poliquétido sintasa, una citocromo p450 monooxigenasa y una sintetasa de péptidos no ribosomales que se postula que son enzimas que deberían estar implicadas en la síntesis de ocratoxina A. A partir de esta información se han diseñado protocolos para la cuantificación de la expresión de estos genes mediante RT-PCR a tiempo real lo que nos está permitiendo estudiar el efecto de las condiciones ambientales sobre la producción de micotoxinas.