Caracterización de proteínas de virulencia bacterianas utilizando la levadura como modelo de célula hospedadora

En colaboración con grupos que trabajan en patogénesis bacteriana, utilizamos la levadura S. cerevisiae como entorno celular para el estudio funcional de proteínas de virulencia de los sistemas de secreción de tipo III, IV y VI de diversas bacterias patógenas. Dichos sistemas de secreción, codificados por islas de patogenicidad genómicas, son estructuras especializadas, a modo de jeringas o arpones moleculares, que inyectan al citoplasma de la célula diana humana unas proteínas, denominadas efectores, cuya función es alterar la señalización intracelular, la dinámica del citoesqueleto y el tráfico vesicular de la célula para establecer un nicho intracelular en el curso de la infección. La conservación de estos procesos celulares en S. cerevisiae convierte a esta levadura en un modelo sencillo para abordar el estudio funcional de estos efectores.

Tras utilizar de forma pionera este sistema modelo con algunos efectores de función conocida de Salmonella Typhimurium (SopE, SptP, SopB, SteC, SteA) y cepas enteropatógenas de Escherichia coli, hemos extendido el estudio a efectores de otras bacterias, como Coxiella burnetti, Brucella abortus, Klebsiella pneumoniae y Legionella pneumophila. 

Diagrama de trabajo para estudios en levadura de efectores de virulencia bacterianos de función desconocida

Plataformas basadas en levadura para el ensayo de compuestos antivirales

Recientemente hemos logrado implementar dos nuevos modelos de levadura que consisten respectivamente en la expresión de las proteasas del SARS-CoV2 Mpro/3CLpro y PLpro, ambas esenciales para la supervivencia y maduración del virus en las células infectadas, así como para la manipulación de su maquinaria celular para la evasión de la respuesta inmunitaria. En consecuencia, estas proteasas resultan dianas farmacológicas ideales para el desarrollo de antivirales. Debido precisamente a que su expresión conlleva una inhibición patente del crecimiento de la levadura en ambos casos, es posible emplear el sistema para detectar antivirales, que, al inhibir la función de estas proteasas, recuperen su crecimiento.

Otro de nuestros objetivos es emplear la levadura como modelo eucariótico para estudio del mecanismo molecular por el que Mpro/3CLpro y PLpro logran interferir con el funcionamiento de las células infectadas por el SARS-CoV2. Se sabe que algunas de las proteínas que forman parte de la respuesta innata antiviral son dianas de las proteasas del SARS-CoV2. Nuestro laboratorio ha desarrollado previamente un sistema de levadura humanizada expresando gran parte de los elementos involucrados en esta respuesta, que pretendemos explotar para analizar la capacidad de las proteasas para modificar dichos componentes.

 

Characterization of bacterial virulence proteins that interfere with cell signaling by heterologous expression in yeast

In collaboration with several groups that work on bacterial pathogenesis, we proposed back in 2001 the yeast model as a tool for the study of effector proteins translocated into the host cells by the type III, IV and VI secretion systems of pathogenic bacteria. These systems consist of a specialized structure resembling molecular syringes that literally inject bacterial effectors to the cytoplasm of the target host cell, frequently epithelial cells to trigger invasion or phagocytes to avoid the innate immune response. The function of translocated effectors is to subvert intracellular cell signaling, cytoskeletal dynamics and vesicular traffic to favour a stage of intracellular bacterial survival or proliferation. Given that cellular functions modulated by such effectors, especially those related to modulation of cell signaling, are often conserved between yeast an higher cells, our model can contribute to the elucidation and study of the function of such virulence factors.

Our initial studies in this field involved setting up the model and proof-of-principle by expressing type III-secreted effectors from Salmonella Typhimurium (SopE, SptP, SopB, SteC, SteA) and enteropathogenic Escherichia coli strains, More recently, we have extended our studies to Type IV-translocated effectors from Coxiella burnetti or Brucella abortus and Legionella pneumophila, as well as to Type VI efector proteins of Klebsiella pneumoniae. 

Strategy for the development of in vivo pharmacologic assays on coronavirus proteases

Yeast-based platforms to assay antiviral compounds

We have recently assembled two yeast models expressing, respectively, the Mpro/3CLpro and PLpro proteases from SARS-CoV2 , both essential for the survival and maturation of the virus in infected cells, as well as to subvert the host cell to evade innate immunity. In consequence, these proteases are key pharmacologic targets for the develpment of antiviral drugs. The expression of both proteases in yeast leads to severe growth inhibition, allowing us to exploit the system to assay potential antiviral compounds that are able to restore cell growth upon specific inhibition of the viral proteases.

Another objective is to exploit our humanized yeast systems that express diverse components of innate immunity pathways to gain insight into the mechanisms by which Mpro/3CLpro and PLpro interfere with the defences of SARS-CoV2-infected cells. Some of the proteins involved in innate immune signaling and regulated cell death are proteolytic targets of viral proteases. We beleive that yeast could be a suitable platform to study the functional interactions between viral proteins and their targets at a molecular level.

Toxicity of active SARS-CoV-2 MPro/3CLPro in yeast and in vivo inhibition dose-response curve by a specific compound