Hace varios siglos, se comenzó a observar al microscopio la presencia de microorganismos de algo que se denominaba “moco” sobre diferentes superficies como las rocas de los ríos o los dientes. A finales del siglo pasado, el científico John William Costerton acuñó el término biofilm para referirse a este “moco”. Estudios recientes demuestran la importancia de desarrollar fórmulas para su correcta eliminación de superficies presentes en la industria alimentaria o en los dispositivos de alimentación asistida utilizados en los hospitales, ya que son superficies fácilmente colonizadas por patógenos que pueden conllevar un riesgo para la salud. En este sentido, el Grupo PROBILAC de la Universidad Complutense de Madrid ha llevado a cabo un estudio utilizando diferentes técnicas de imagen para estudiar la capacidad de formación de biofilms en este tipo de superficies con el fin de buscar nuevas maneras efectivas de combatirlos.

Vista del biofilm utilizando microscopía confocal y tinciones de componentes de matriz

13 de noviembre de 2024. Los biofilms o biopelículas bacterianas son comunidades microbianas complejas embebidas en una matriz polimérica y adheridas a una superficie. Esta compleja forma de vida aporta beneficios a sus integrantes, como protección frente a su eliminación, favoreciendo su persistencia en superficies de riesgo como las que se encuentran en contacto directo con los alimentos. Además, su comportamiento está directamente relacionado con su composición bacteriana, por lo que se necesita conocer cómo se encuentran estructurados tanto sus integrantes como los componentes de la matriz, con el fin de desarrollar técnicas de eliminación eficaces.

Hace varios siglos que se comenzó a observar en el microscopio la presencia de microorganismos en algo que se denominaba “moco” sobre diferentes superficies como las rocas de los ríos o los dientes. John William Costerton lo definió a finales del siglo pasado como un conjunto de microorganismos embebidos en una matriz (fluido pegajoso) autoproducida y adheridos a una superficie o formando agregados entre ellos. Estas estructuras están formadas principalmente por agua, microorganismos y una matriz rica en carbohidratos, proteínas o ADN extracelular, que aporta beneficios y funcionalidades que optimizan la supervivencia celular. Su estructura interna sigue una distribución espacial ordenada y mediada por las relaciones ecológicas dadas entre sus componentes.

En el laboratorio disponemos de una gran cantidad de técnicas de imagen y herramientas para el estudio de esta forma de vida, partiendo desde las más clásicas como el uso de medios de cultivo sólidos o análisis en microplaca, pasando por técnicas new era como la aplicación de las ciencias “ómicas” (métodos basados en la biología molecular), hasta diferentes técnicas de microscopía que pueden arrojar información complementaria sobre su comportamiento.

Entre las técnicas de imagen más utilizadas en este campo encontramos la microscopía electrónica de barrido (SEM) o la microscopía confocal láser (Figura 1). Esta última es especialmente relevante ya que, debido a sus posibilidades, aporta información en 3D sobre la distribución interna de la estructura, presencia y supervivencia de los microorganismos o incluso información cuantitativa del biovolumen de los componentes que nos interesen. Esto permite utilizar esta información para buscar soluciones más eficaces para su eliminación de superficies en contacto directo con los alimentos, así como para verificar su limpieza y desinfección. Algunas de estas superficies las encontramos presentes en la industria alimentaria o en los dispositivos de alimentación asistida utilizados en hospitales, ambas muy susceptibles a ser colonizadas por patógenos cuando no se encuentren en las condiciones higiénicas idóneas.

Figura 1. Imágenes de microscopía SEM y confocal de biofilms de Limosilactobacillus reuteri (A, B y E) y Ligilactobacillus salivarius (C, D y F). Fuente: Elaboración propia.

En este contexto, nuestro trabajo ha consistido en la aplicación de diferentes tipos de microscopía para estudiar la capacidad de formación de biofilms de microorganismos aislados de este tipo de superficies, con el fin de buscar maneras efectivas de combatirlos. Una de las aplicaciones que puede tener la imagen del biofilm es conocer las relaciones entre microorganismos potencialmente patógenos y bacterias lácticas con potencial probiótico (Figura 2). Así, se puede evidenciar si estos potenciales probióticos pueden inhibir o disminuir la adhesión a superficies de patógenos presentes tanto en hospitales como en la industria alimentaria, como es el caso de Staphylococcus spp. resistentes a antibióticos, enterobacterias responsables de brotes epidemiológicos o patógenos especialmente peligrosos para la seguridad alimentaria como Listeria monocytogenes.

Figura 2. Ejemplo de distribución espacial de Listeria monocytogenes (verde) y Limosilactobacillus fermentum (rojo) dentro de un biofilm mixto utilizando microscopía confocal. Las capas más profundas están formadas principalmente por el L. fermentum, mientras que Listeria aprovecha este acondicionamiento para adherirse a estas estructuras preformadas.

Por otro lado, las imágenes adquiridas en biofilms empleando tinciones vitales pueden servir para comprobar el efecto de metabolitos con efecto antimicrobiano en la viabilidad de las especies integrantes del biofilm. Algunas aplicaciones más ambiciosas proponen la combinación de diferentes tipos de microscopía para conocer en detalle la organización espacial de los componentes mayoritarios de la matriz del biofilm, concretamente de los carbohidratos y las proteínas (Figura 3). Estos son considerados potenciales factores de virulencia al estar directamente relacionados con la dureza y adhesión de las capas más profundas del biofilm. Conocer cómo se estructuran podría guiar el desarrollo de estrategias más dirigidas para conseguir su eliminación.

Figura 3. Estudio de la distribución espacial y biovolumen de carbohidratos (rojo) y proteínas (verde) en diferentes biofilms utilizando microscopía confocal y tinciones específicas comerciales. Fuente: elaboración propia.

Por último, es importante recalcar la importancia de combinar técnicas de imagen de alta resolución con marcajes específicos dirigidos (sondas de ADN), como es la técnica FISH (Fluorescent in-situ hybridization). Gracias a esta combinación, es posible “mapear” biofilms multiespecie a través de su reproducción y marcaje en el laboratorio, especialmente cuando la naturaleza de la muestra impide un acceso directo al estudio, debido a  que se  encuentran en zonas pequeñas (como pequeñas grietas en tuberías) o a la dificultad de acceso directo a su estudio porque la estructura del propio biofilm se modifica al intentar muestrearlo. Es por todo esto que, conocer la distribución espacial de las células y los componentes de la matriz de estos biofilms resulta fundamental para desarrollar estrategias efectivas que permitan su control y eliminación, minimizando el impacto de estas peligrosas estructuras sobre los alimentos y la salud del consumidor.

Autores: Josué Jara Pérez^1,3, Juan Miguel Rodríguez Gómez^2,3 y Belén Orgaz Martín^1,3 (Grupo PROBILAC UCM920080)

¹Sección Departamental de Farmacia Galénica y Tecnología Alimentaria, ²Sección Departamental de Nutrición y Ciencia de los Alimentos y ³Instituto Pluridisciplinar de la Universidad Complutense de Madrid

Enlaces para más información: 

Jara, J., Jurado, R., Almendro-Vedia, V. G., López-Montero, I., Fernández, L., Rodríguez, J. M., & Orgaz, B. (2022). Interspecies relationships between nosocomial pathogens associated to preterm infants and lactic acid bacteria in dual-species biofilms. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 12, 1038253.

Jara, J., Pérez-Ramos, A., Del Solar, G., Rodríguez, J. M., Fernández, L., & Orgaz, B. (2020). Role of Lactobacillus biofilms in Listeria monocytogenes adhesion to glass surfaces. International Journal of Food Microbiology, 334, 108804.