Esta Tesis Doctoral, titulada “Establecimiento de protocolos de terapias avanzadas, génica y celular, para el tratamiento del déficit de factor V y factor VIII de la coagulación”, trata de establecer las bases para desarrollar un tratamiento eficaz, específico y potencialmente curativo, frente a estas dos enfermedades raras de índole hemorrágico, mediante terapias avanzadas, génica y celular.
Las enfermedades raras o poco frecuentes son aquellas cuya incidencia en la población está por debajo de 1 caso por cada 2000 personas. Muchas de ellas no disponen de diagnóstico ni de un tratamiento específico y eficaz. Por ello es necesario la investigación y el desarrollo de nuevos fármacos para este tipo de enfermedades. Las coagulopatías congénitas raras, como son el déficit de factor V o de factor VIII, cursan con hemorragias más o menos graves en función de los niveles del factor de coagulación presentes en plasma. El plasma fresco congelado, que se utiliza en el déficit de factor V, es poco eficaz y su utilización es a demanda en base a la necesidad por un episodio hemorrágico. Por su parte los concentrados de factor VIII se administran por vía intravenosa en el déficit de factor VIII, en régimen de profilaxis, dos o tres dosis a la semana. Estos tratamientos son tediosos y de baja adherencia para el paciente, por lo que se hace absolutamente necesario el desarrollo de un tratamiento “curativo” a largo plazo que sea capaz, o bien de suplir de forma continuada el factor deficitario, o bien de corregir el defecto genético. Estos tratamientos curativos solo lo ofrecen las nuevas terapias avanzadas y serían una muy buena alternativa para este tipo de pacientes.
Los objetivos de este trabajo están orientados a desarrollar protocolos o estrategias, basadas en terapias avanzadas, como la terapia celular y la terapia génica, para tratar, de manera eficaz y específica, ambas patologías.
En cuanto a terapia celular, los resultados obtenidos en este estudio muestran que la formación de hepatosferas funcionales obtenidas a partir de la diferenciación hepática de células madre mesenquimales de decidua de placenta humana, son capaces de expresar el gen de factor V de la coagulación, pero no el de factor VIII. El micro trasplante de estas hepatosferas podría ser una buena alternativa para aumentar los niveles de factor V en el plasma.
Se aplicó una estrategia de injerto neonatal de células embrionarias en modelo murino, como fase muy preliminar para terapia celular neonatal, que demostró que los tejidos embrionarios con mayor expresión de F5 y F8 son el hígado fetal y la región de la aorta-gónada-mesonefros, respectivamente. Estos tienen un gran potencial de injerto tisular neonatal, pudiendo aumentar los niveles de factor V y factor VIII en el plasma de los individuos injertados. 2.
En cuanto a terapia génica, el trabajo se ha centrado en la edición génica mediante la herramienta CRISPR/Cas9 sobre el gen F5, pudiéndose extrapolar todas las técnicas aplicadas al F8 debido a su gran homología y a que comparten las mismas rutas de biogénesis, activación y degradación. En este estudio se analizaron las mutaciones en el gen F5, así como la segregación familiar, en dos pacientes con déficit severo de factor V. Posteriormente se desarrolló un modelo celular, in vitro, en la línea celular HepG2 mediante CRISPR/Cas9, simulando con exactitud una mutación de fenotipo patológico de una de las pacientes. Mediante la misma técnica se revirtió la mutación y se estudió el factor V producido por las células. El resultado fue la producción de factor V con función coagulante normal.
En conclusión, se ha desarrollado y optimizado un protocolo sencillo de diferenciación hepática, con la formación de “organoides” hepáticos tridimensionales, capaces de expresar el gen del factor V de la coagulación. Por otro lado, en el estadio 12 del desarrollo embrionario de ratón, el hígado fetal se mostró como el órgano con mayor expresión de F5 y la región aorta-gónada-mesonefro la de mayor expresión de F8. Las células derivadas de ambos tejidos poseen un gran potencial de injerto en ratones neonatos, pudiendo aumentar los niveles de ambos factores en plasma.
La edición génica mediante la herramienta CRISPR/Cas9, y siguiendo la estrategia de deleción precisa por unión de extremos no homólogos, ha resultado muy efectiva para modelizar, in vitro, la mutación detectada en el gen F5 de la paciente, en la línea celular HepG2, simulando el fenotipo patológico. Ha demostrado también su eficacia de un 41% en la corrección de dicha mutación, obteniéndose una proteína nuevamente funcional, que, extrapolándose a los valores clínicos de referencia, podría traducirse, en condiciones ideales, en la reversión de un fenotipo grave a uno leve asintomático de la enfermedad
